膀胱癌（尿路上皮癌）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤的第9位，死亡率居恶性肿瘤的第13位，具有早期症状不明显，发病后进展迅速，明确诊断及精准分级分期困难等特点。膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌（NMIBC/MIBC）两类，二者在肿瘤生物学行为、治疗及预后方面均存在明显差异。膀胱癌的临床治疗依赖于肿瘤的准确分期，不准确的分期将导致患者生存率降低或非必要的手术。目前膀胱癌诊断和监测的"金标准"为组织病理学检查，而病理学检查必须依赖有创且费用高的膀胱镜活检或者诊断性电切获取组织。目前报道的无创诊断方法灵敏度和特异性较低，无法区分低级别和高级别（LG/HG）膀胱癌及NMIBC/MIBC。因此，开发出更加准确且能够分辨肿瘤分期分级的无创诊断及监测方法是临床的迫切需求。

异常的DNA甲基化在多种肿瘤中均有发现，特异性DNA甲基化可用于肿瘤检测及亚型的精确分类。在前期研究中，本团队通过全基因组亚硫酸氢盐测序，发现膀胱癌组织中不同的甲基化改变与膀胱癌谱系和恶性程度密切相关[2]。在本研究中，研究人员利用多样性算法对前述膀胱癌特异的甲基化特征区域进行了统计分析。分析结果表明，膀胱癌特异性的甲基化特征一部分继承自肿瘤祖先细胞，另一部分来自肿瘤发生发展过程中的促癌DNA甲基化修饰。前者包括GALNT6、IRX2等基因座，阐明肿瘤的谱系来源；后者包含HOXC8、SOX2等基因座，与肿瘤的转化、进展情况密切相关。为了进一步证明促癌DNA甲基化修饰与膀胱癌发生发展之间存在因果关系，研究人员采用了单细胞测序和CRISPR-Cas9敲除实验体系进行功能学验证。研究人员发现，SOX2基因座附近的膀胱癌特异促癌DNA甲基化修饰位点与SOX2启动子相互作用，构成了多层转录调控网络。敲除任意一个上述修饰位点均导致SOX2基因表达下调，全局性地下调SOX2下游基因转录，削弱膀胱癌细胞系的增殖浸润能力，其作用相当于SOX2基因敲除，证明了促癌DNA甲基化修饰位点是原癌基因的正向调控因子。

通过对膀胱癌甲基化特征进行精确分类，研究人员提出，可以利用这类与膀胱癌发生发展存在因果关系的DNA甲基化特征，实现膀胱癌无创诊断与监测。在本研究的训练队列中，研究人员在膀胱癌组织和正常尿液样本上建立了一种针对特异性DNA甲基化特征的靶向测序分析方法。随后，在多中心前瞻性临床验证队列中以双盲方式对259份尿液样本进行检测。结果显示，膀胱癌基因组DNA甲基化图谱可以准确地区分膀胱肿瘤组织与正常尿液，同时可准确地区分LG/HG以及MIBC/NMIBC，其区分能力显著优于基因突变或RNA表达谱。检测术前尿游离DNA甲基化特征对于诊断HG膀胱癌灵敏度为100% （95%CI：82.5%-100%），对于LG膀胱癌灵敏度为62% （95%CI：51.3%-72.7%），二者特异性均为100%，其灵敏度特异性均显著优于FISH方法。检测术后尿游离DNA甲基化特征用于预测180天内无复发生存率，预测阴性患者无复发的准确率为100%，远期随访验证持续进行中。

综上所述，检测尿液游离DNA甲基化在诊断膀胱癌、预测复发和预测预后方面优于FISH和DNA突变。该方法有助于减少不必要的侵入性检测，不仅减轻了患者的身体不适与经济负担，还降低了一些非必要手术相关的风险。该研究的发现不仅对膀胱癌诊断和监测具有实践意义，也提示类似方法在其他肿瘤中的广泛应用的潜能。

武汉大学中南医院生物样本库的肖宇博士、鞠林高博士、钱开宇博士和优乐复生的金婉博士是本文的共同第一作者，王行环教授与张翼博士为本文的共同通讯作者。本研究的计算工作由北京大学生命科学联合中心“北极星”计算平台支持，纽约大学邓方明教授为本研究提供了病理学指导。参与本研究的单位包括武汉大学中南医院、首都医科大学附属北京友谊医院、北京大学国际医院、恩施州中心医院、攀枝花学院附属医院。该研究由国家卫生健康委员会、湖北省科学技术厅、中国医学科学院、武汉大学中南医院支持，在北京优乐复生和武汉大学中南医院完成。

1. Xiao Y, Ju L, Qian K, et al. Non-invasive diagnosis and surveillance of bladder cancer with driver and passenger DNA methylation in a prospective cohort study. Clin Transl Med.2022;12(8):e1008.doi:10.1002/ctm2.1008.

2. Xiao Y, Jin W, Qian K, et al. Emergence of an adaptive epigenetic cell state in human bladder urothelial carcinoma evolution. bioRxiv. 2021. Preprint at https://doi.org/10.1101/2021.10. 30.466556.